Escrito por Fernando Garcia
Introdução
Cromatografia é uma técnica bastante importante quando falamos de química analítica, principalmente para analises qualitativas e não tão quantitativas. Basicamente cromatografia é um método de separação de misturas que nos ajuda a identificar quantos componentes certas misturas possuem, a polaridade desses componentes e até tamanho de cadeias poliméricas, como no caso da GPC. Neste material vamos ver 4 tipos gerais de cromatografia, são elas: Cromatografia de camada delgada, cromatografia líquida em coluna e cromatografia gasosa.
Definições importantes
Aqui vamos definir alguns conceitos que usaremos durante a aula, para que possamos desenvolver as explicações de forma mais sucinta e rápida. Na maioria das cromatografias, o princípio básico de funcionamento é aplicar a amostra em uma fase estacionária, que não se move durante o processo, e passar eluente, algum solvente geralmente orgânico que chamamos de fase móvel, no processo de eluição. Eluição é como chamamos o processo em que o eluente passa pela fase estacionária separando os componentes da amostra.
Aqui temos um exemplo de uma CCD. Neste caso a fase estacionária é a placa branca de sílica, bastante polar. Note que antes da eluição, a amostra estava já aplicada na fase estacionária de sílica e com a passagem do eluente a mistura é separada devido a diferença de polaridade entre os componentes.
Cromatografia de Camada Delgada
Esta é a técnica de cromatografia mais famosa e bastante usada devido a sua simplicidade e eficácia no que se propõe. Nela, a fase móvel, ou eluente, passa por capilaridade pela placa de sílica que usamos como fase estacionária. A medida que o eluente arrasta os componentes da amostra, eles se separam por terem diferentes graus de polaridade. Como a nossa fase estacionária de sílica é bastante polar, aquelas substâncias que forem mais polares interagem melhor com a plaquinha, sendo arrastadas com menos facilidade pelo eluente no processo de eluição.
Tem alguns detalhes importantes quando entramos na questão de fazer e preparar uma amostra para realizar a CCD. A primeira coisa que devemos nos atentar é na preparação da plaquinha. Para preparar uma placa de sílica pra realizar uma CCD, temos que fazer duas linhas horizontais nela, cada uma perto de cada uma das bases da placa. Isso é importante para posteriormente calcularmos os fatores de retenção de cada uma das substâncias separadas. Cada substância teu seu Rf específico nas condições do experimento, deste modo, calcular esse valor é importante para identificar quais são as substâncias separadas. No caso da CCD, o Rf é calculado dividindo a distancia que o spot da amostra percorreu, pela distancia entre as duas linhas horizontais com lápis. Nunca usamos canetas em placas de CCD pois a tinta vai ser separada na eluição.
Para aplicar a amostra a ser separada, usamos um capilar de vidro, que usamos para pegar a amostra e, delicadamente, fazer os spots (ou seja, adição da amostra no formato de uma bolinha) da amostra na linha inferior feita anteriormente na placa de sílica. Uma vez feito isso, preparamos o eluente que usaremos na nossa CCD, ele geralmente é uma mistura em proporções predeterminadas de solventes orgânicos.
Com a mistura do eluente feita, vamos preparar a câmara de eluição, que é onde vai ocorrer a nossa etapa de eluição. Assim como na imagem mostrada no inicio da nossa aula, essa câmara geralmente é um béquer com um vidro de relógio tampando, isso evita que o nosso eluente volátil escape durante a eluição. Antes de iniciar a eluição, devemos adicionar eluente suficiente na câmara para que fique imediatamente abaixo da linha horizontal que contém os spots a serem separados, se houver contato nossa cromatografia pode dar errado já que a amostra contida no spot pode ir parar no eluente. Uma vez com o eluente adicionado, deixamos ele no recipiente com a tampa fechada para que haja saturação da atmosfera da câmara e só aí adicionamos a plaquinha da CCD para que ocorra a eluição corretamente.
Após realizada a eluição, temos que marcar onde os spots pararam para medir a distância e calcular os Rf's. Se os spots forem visíveis a olho nu, perfeito, pode-se apenas marcar as bolinhas com lápis e começar as medidas. Contudo, caso os spots não sejam visíveis, precisamos revelá-los. A primeira maneira de se revelar um spot, é com uma câmara uv. Caso você esteja trabalhando com substâncias com largas cadeias de ressonância ou anéis aromáticos, ao expor a placa à luz ultravioleta, os spots vão brilhar, revelando sua posição. Assim, após revelar os spots com luz uv, apenas marcamos eles com lápis e calculamos os Rf's.
Caso a sua revelação não possa ser feita com luz uv, pode-se recorrer ao permanganato para revelar. Esse método funciona quando estamos trabalhando com substâncias que podem sofrer algum tipo de oxidação. Apenas mergulhamos a placa em uma solução de permanganato e depois secamos à quente, os spots ficam visíveis para que se possa determinar os Rf's das substâncias em questão. Veja a imagem a seguir.
Cromatografia Líquida de Coluna
A cromatografia de coluna tem o mesmo princípio de funcionamento de uma CCD, contudo, temos algumas peculiaridades. As mudanças já começam no fato de que a sílica fica presa em uma coluna de vidro, similar a uma bureta. Nela que adicionamos a amostra e o eluente regularmente. As substâncias se separam no mesmo esquema da CCD, por diferença de polaridade e consequente diferente interação com a sílica, o que faz com que elas se movam pela fase estacionária com velocidades diferentes.
Para empacotar a sílica na coluna, colocamos um algodãozinho no fundo da vidraria e então adicionamos a sílica. Após isso, adicionamos mais um pouco de algodão e uma leve camada de areia para que a camada de sílica não seja perturbada. É importante que no processo de empacotamento não se formem buracos na estrutura da sílica. Uma vez empacotada, adicionamos o eluente e encharcamos tudo. Agora apenas adicionamos a amostra e vamos adicionando eluente continuamente até que as substâncias se separem. A sílica nunca deve ficar seca. Dá para acompanhar a eficiência da separação a olho nu, ou realizando CCD's ao passar da eluição.
Cromatografia gasosa
A cromatografia gasosa (CG) é uma técnica bem mais tecnológica e mais eficiente que as demais. Nela, temos uma máquina maciça onde a nossa amostra, geralmente líquida é injetada e rapidamente vaporizada. Esse vapor é carregado por um eluente gasoso, na maioria dos casos um gás inerte, pela fase estacionária, que é um cano bem grande que tem sílica em suas paredes internas. O mecanismo de separação é o mesmo da CCD e da CC. Após o período de eluição, a máquina que é equipada com um sensor, manda os dados para um computador, onde é dado o tempo de eluição de cada uma das substâncias contidas na amostra. Veja o aparelho a seguir.
Conclusão
Cromatografia é uma técnica muito útil na química analítica. Agora que você já conhece um pouco mais sobre essa técnica busque se aprofundar mais vendo vídeos práticos no youtube e fazendo exercícios sobre. Bons estudos!