Uma das principais dificuldades da biologia celular é localizar proteínas específicas dentro de células e tecidos. Embora organelas como núcleo e mitocôndrias possam ser observadas por diferentes técnicas de microscopia, a maioria das proteínas não apresenta contraste suficiente para ser visualizada diretamente.
Para contornar esse problema, utilizam-se técnicas baseadas na interação altamente específica entre antígenos e anticorpos. Entre as mais importantes estão a imunocoloração (ou imunohistoquímica, quando aplicada a tecidos, ou imunocitoquímica, quando aplicada em células isoladas ou culturas) e a imunofluorescência, amplamente empregadas em pesquisa básica, diagnóstico e desenvolvimento de novas terapias.
Princípio da técnica
Ambas as técnicas exploram a alta especificidade da ligação entre um anticorpo e seu antígeno, que corresponde à proteína de interesse. Antes da marcação, as amostras geralmente passam por etapas de fixação, que preserva a estrutura celular, e de permeabilização, quando é necessário permitir que os anticorpos atravessem a membrana plasmática e alcancem proteínas localizadas no interior da célula.
Após a incubação com um anticorpo específico, é necessário tornar essa ligação detectável. A diferença entre imunocoloração e imunofluorescência está justamente no método utilizado para essa detecção.
Imunocoloração
Na imunocoloração, o anticorpo é associado a uma enzima, geralmente a peroxidase de rábano (HRP) ou a fosfatase alcalina (AP). Após a adição de um substrato cromogênico, ocorre uma reação enzimática que produz um precipitado insolúvel colorido exatamente no local onde o anticorpo está ligado.
Como o produto da reação é permanente, as lâminas podem ser armazenadas por longos períodos e analisadas em microscópios ópticos convencionais. Além disso, a coloração obtida é estável e apresenta boa resolução para análises histológicas.
Essa técnica é amplamente utilizada na rotina da anatomia patológica para identificar marcadores tumorais, determinar a origem de determinados cânceres e auxiliar na definição do tratamento mais adequado para o paciente.
Imunofluorescência
Na imunofluorescência, o anticorpo é conjugado a um fluoróforo, molécula capaz de absorver luz em um determinado comprimento de onda e emitir fluorescência em um comprimento de onda maior.
Quando observada em um microscópio de fluorescência ou confocal, a proteína marcada aparece emitindo luz, permitindo determinar sua localização intracelular com alta precisão. Em microscopia confocal, também é possível obter imagens em diferentes planos da amostra, possibilitando reconstruções tridimensionais da célula ou do tecido.
Uma das principais vantagens dessa técnica é a possibilidade de utilizar fluoróforos diferentes em um mesmo experimento, permitindo a marcação simultânea de diversas proteínas. Dessa forma, é possível verificar se duas proteínas estão presentes na mesma região celular (colocalização), fornecendo informações importantes sobre suas possíveis interações e funções.
Imunofluorescência direta e indireta
A detecção pode ser realizada de duas formas.
No método direto, o fluoróforo ou a enzima está ligado diretamente ao anticorpo que reconhece o antígeno. Como apenas um anticorpo participa da reação, o procedimento é mais rápido e reduz o risco de ligações inespecíficas. Entretanto, a intensidade do sinal costuma ser menor.
Já no método indireto, utiliza-se inicialmente um anticorpo primário específico para a proteína-alvo. Em seguida, adiciona-se um anticorpo secundário marcado, capaz de reconhecer o anticorpo primário.
Esse é o método mais empregado, pois vários anticorpos secundários podem se ligar a um único anticorpo primário, amplificando o sinal e aumentando a sensibilidade da técnica. Além disso, um mesmo anticorpo secundário pode ser utilizado com diferentes anticorpos primários produzidos na mesma espécie, reduzindo custos e tornando os experimentos mais versáteis.
Aplicações
A imunocoloração e a imunofluorescência possuem inúmeras aplicações na biologia e na medicina. Em pesquisa, são utilizadas para estudar a localização, a expressão e a dinâmica de proteínas durante processos como divisão celular, diferenciação e resposta a estímulos. Na prática clínica, desempenham papel fundamental no diagnóstico de doenças, especialmente neoplasias, infecções e doenças autoimunes, além de auxiliarem na identificação de biomarcadores e no desenvolvimento de terapias direcionadas.
Material feito por Carolina Fujimoto.