O Northern blot é uma técnica laboratorial desenvolvida na década de 1970, inspirada no Southern blot, com o objetivo de detectar sequências específicas de RNA em uma mistura complexa de ácidos nucleicos. Essa técnica é amplamente utilizada para estudar níveis de expressão gênica, uma vez que a quantidade de RNA mensageiro (mRNA) presente reflete a atividade de determinado gene.
A técnica foi descrita pela primeira vez por James Alwine, David Kemp e George Stark em 1977. O nome “Northern” é um trocadilho com o “Southern blot”, nomeado por Edwin Southern. Apesar de ser uma técnica clássica, ainda é usada em pesquisas que requerem análise do tamanho exato de transcritos, identificação de variantes de splicing ou confirmação de dados de RNA-Seq.
Apesar da popularização de métodos como RT-PCR quantitativo (qRT-PCR) e RNA-Seq, o Northern blot ainda é valorizado por sua especificidade, visualização direta do tamanho do transcrito e baixo risco de contaminação por DNA genômico.
Vantagens e limitações
Vantagens:
- Permite visualizar o tamanho dos transcritos (útil para detectar isoformas).
- Baixa incidência de falso positivo por contaminação de DNA.
- Técnica relativamente simples e de baixo custo.
Limitações:
- Menor sensibilidade comparada ao qRT-PCR.
- Requer grande quantidade de RNA de boa qualidade.
- Baixa resolução para transcritos de tamanho muito próximo.
- Uso de sondas radioativas pode exigir infraestrutura específica.
Princípios gerais
O Northern blot também se baseia no princípio da hibridização molecular, ou seja, a ligação entre fitas complementares de ácidos nucleicos. Porém, ao contrário do Southern blot, aqui o alvo é RNA (geralmente mRNA), e não DNA. Isso permite investigar quais genes estão ativos e quantificar aproximadamente a abundância de seus transcritos.
Etapas do Northern blot
A técnica inclui os seguintes passos:
1 – Extração de RNA:
O RNA total é isolado de tecidos ou culturas celulares. É fundamental evitar a degradação do RNA por RNases (enzimas extremamente estáveis e onipresentes), utilizando reagentes específicos (como TRIzol) e trabalho em condições estéreis e geladas. O mRNA pode ser separado do RNA total por colunas de oligo(dT) que se ligam à cauda poli-A dos mensageiros.
2 – Eletroforese em gel:
O RNA é separado por eletroforese, geralmente em gel de agarose contendo formaldeído (agente desnaturante que impede a formação de estruturas secundárias no RNA). Isso garante que a separação seja feita apenas com base no tamanho. Um marcador de RNA é incluído para estimar o comprimento dos transcritos.
3 – Transferência para a membrana:
Após a corrida, o RNA é transferido para uma membrana de náilon ou nitrocelulose. A transferência pode ser feita por capilaridade ou eletrotransferência. O RNA se liga à membrana por interações eletrostáticas.
4 – Fixação:
A membrana é tratada com calor ou radiação UV para fixar permanentemente o RNA. Isso é necessário para manter as moléculas de RNA imobilizadas durante os próximos passos.
5 – Hibridização com sonda:
A membrana é incubada com uma sonda complementar à sequência-alvo de RNA. As sondas podem ser marcadas com isótopos radioativos, fluoróforos ou enzimas. A hibridização ocorre em temperatura controlada, em tampão contendo bloqueadores de ligação inespecífica (como tRNA ou salmon sperm DNA).
6 – Lavagem e detecção:
Após a hibridização, a membrana é lavada para remover sondas não ligadas. A detecção depende da marcação da sonda: por autorradiografia (sondas radioativas), fluorescência ou coloração enzimática.
Interpretação dos resultados
As bandas visíveis na membrana correspondem a transcritos de RNA que possuem sequência complementar à sonda utilizada. A posição das bandas permite estimar o tamanho do RNA, enquanto sua intensidade reflete aproximadamente o nível de expressão do gene. Variações no padrão de bandas podem indicar a presença de isoformas, splicing alternativo ou regulação diferencial da expressão gênica. A ausência de banda pode significar que o gene não está sendo expresso ou que o RNA foi degradado.
Exemplo:
O painel superior mostra um Northern blot usando uma sonda específica para o miR-502-3p, que é uma das formas maduras do microRNA miR-502. MicroRNAs são pequenos RNAs que não codificam proteínas, mas regulam a expressão de genes em células eucarióticas. O objetivo aqui é observar a quantidade de miR-502-3p produzida em diferentes amostras (linhas 1 a 9).
O painel do meio mostra o mesmo tipo de análise, mas agora usando uma sonda para a outra forma madura, o miR-502-5p.
Já o painel inferior apresenta os controles do experimento:
- U2, um RNA usado como controle de carregamento, para verificar se todas as amostras têm quantidades semelhantes de RNA.
- siRNA-1, um RNA artificial usado como controle de transfecção, para confirmar que a introdução do material genético nas células foi bem-sucedida.
As amostras estão organizadas assim:
- Linhas 1, 3, 5 e 6: células com o miR-502 normal (sem mutação).
- Linhas 2, 4, 8 e 9: células com a variante miR-502-C/G.
- Linha 7: controle com vetor vazio (sem nenhum miRNA).
- Linha 0: marcador de peso molecular (MW), usado para estimar o tamanho dos fragmentos de RNA.
Conclusão:
As bandas nos painéis superiores são mais fracas nas amostras com a variante miR-502-C/G (linhas 2, 4, 8 e 9), mostrando que essa mutação prejudica a produção das formas maduras do miRNA. Isso sugere que a mutação C/G afeta o processamento do miR-502.
Os controles no painel inferior (U2 e siRNA-1) confirmam que o RNA foi bem carregado nas amostras e que a transfecção funcionou corretamente.