Eletroforese
Esta aula terá como foco a técnica de eletroforese de proteínas (SDS-PAGE) e de ácidos nucleicos (gel de agarose) e suas aplicações.
Generalidades
A eletroforese é uma técnica que visa a separação de macromoléculas (DNA, RNA e proteínas) de acordo com sua massa molecular, a partir da aplicação de uma corrente elétrica. Para sua realização, as amostras em questão são adicionadas a um gel e por este gel é aplicada uma corrente, que faz com que as macromoléculas carregadas migrem em direção ao polo de carga oposta. Após algum tempo, as amostras formam diversas bandas (fragmentos de mesmo tamanho), que podem ser visualizadas após revelação.
Esse procedimento possui algumas características comuns básicas:
- Separação por tamanho: as amostras de menor massa correm mais por serem menores e, assim, sofrerem menos resistência por parte do gel. Uma característica é que a separação ocorre em escala logarítmica, ou seja, uma banda que correu duas vezes mais que outra não terá necessariamente metade da massa;
- Padrão de massas: para a determinação da massa molecular das bandas em questão, aplica-se em um dos poços do gel uma amostra com macromoléculas de tamanho já conhecido (padrão de massas) que será usada como escala;
- Corantes: de foram geral, as macromoléculas nas amostras não podem ser vistas a olho nu, por isso faz-se necessária a utilização de corantes para a visualização das bandas.
Ácidos Nucleicos
A eletroforese de ácidos nucleicos (DNA e RNA) é feita em um gel polimérico (agarose ou poliacrilamida), sendo mais simples que a proteica. Como os ácidos nucleicos são carregados negativamente devido à presença de grupamentos fosfato, todos correrão para o polo positivo da cuba de eletroforese do tipo horizontal, sem a necessidade de aditivos.
O gel mais usado para a separação de ácidos nucleicos é o de agarose, com diferentes concentrações para cada faixa de massa molecular (vide tabela abaixo). Também pode ser usado um gel de poliacrilamida para separações mais precisas de até um par de bases (pb), sendo usado para sequenciamento de ácidos nucleicos (sequenciamento Sanger).
Os corantes principais para visualização das bandas são: o brometo de etídio (EtBr) - que está caindo em desuso pelo fato de ser cancerígeno - o GelRed®, SYBR Green® e GelGreen®. As bandas geralmente só podem ser visualizadas com aplicação de luz UV sobre o gel.
Proteínas
A separação de proteínas por eletroforese é um processo complexo e possui diversos tipos, sendo as mais comuns:
- SDS-PAGE: permite a separação de proteínas exclusivamente pela massa molecular. Nesse procedimento, as proteínas são desnaturadas (para que a conformação tridimensional não afete a migração) e tratadas com SDS, o qual confere a todas as proteínas carga negativa, permitindo que estas migrem para o polo positivo da cuba eletroforética do tipo vertical. A revelação das bandas pode ser feita principalmente pelo uso do corante Azul de Coomasie ou com nitrato de prata (que envolve várias etapas);
- Eletroforese bidimensional: a separação ocorre em duas dimensões. Primeiramente as proteínas são separadas em uma dimensão pelo seu ponto isoelétrico (pI). Em seguida, ocorre uma separação por massa molecular (SDS-PAGE) em um segundo eixo, formando uma distribuição de pontos proteicos com diferentes pIs e tamanhos. A revelação pode ser feita pelas técnicas descritas acima.
- Eletroforese capilar: é realizada em um fino tubo de vidro ao invés da cuba eletroforética. O resultado é captado digitalmente e plotado na forma de um gráfico de absorbância em função do tempo;
Aula elaborada por Igor Bersanetti Gabilondo