Enzimas - Bioquímica

Autor: Davi Maricato

Enzimas são catalisadoras biológicas essenciais para que a química da vida se torne possível. Sem elas, praticamente nenhuma reação bioquímica seria capaz de ocorrer em velocidade compatível com os processos celulares. As enzimas são, em sua grande maioria, globulares, tópico discutido anteriormente na aula sobre proteínas, e sua capacidade catalítica é consequência direta de sua estrutura tridimensional. Como outros catalisadores, as enzimas são capazes de reduzir a energia de ativação necessária para a colisão efetiva e formação do complexo ativado, contribuindo, portanto, para o andamento da reação.

Composição e Nomenclatura

As enzimas são, em sua maioria, proteínas globulares caracterizadas por sua alta especificidade catalítica¹. Como vimos anteriormente na aula sobre proteínas do Curso NOIC de Química Orgânica, proteínas globulares possuem mais de um tipo de estrutura secundária e uma estrutura terciária complexa. São essas características que possibilitam a formação de uma cavidade tridimensional específica, denominada sítio ativo, onde o processo catalítico de fato ocorre.

Algumas enzimas são funcionais por si só, isto é, são compostas exclusivamente por proteínas, sendo classificadas como enzimas simples. Entretanto, outras requerem moléculas acessórias para exercerem sua atividade, sendo nesse caso chamadas de holoenzimas². As holoenzimas são compostas pela porção proteica, denominada apoenzima³, e por um componente não proteico essencial, o cofator.

Os cofatores podem ser divididos em dois grupos. O primeiro tange os cofatores inorgânicos, tipicamente íons metálicos como Fe²⁺, Mg²⁺, Zn²⁺, Mn²⁺ e Cu²⁺, que participam diretamente da catálise ao estabilizar cargas negativas, mediar as transferências de elétrons ou coordenar substratos no sítio ativo.

O segundo grupo são as coenzimas, moléculas orgânicas tipicamente de baixa massa molecular, frequentemente derivadas de vitaminas, que atuam como transportadoras de grupos químicos específicos entre diferentes enzimas. Exemplos clássicos e reconhecíveis incluem o NAD⁺ e o NADP⁺ (transportadores de elétrons e de íons H⁻ derivados da niacina/vitamina B3), o FAD, e a coenzima A (CoA-SH).

Quanto à nomenclatura, as enzimas recebem o sufixo -ase acrescentado ao nome do substrato sobre o qual atuam ou ao tipo de reação que catalisam. Podemos ver o uso dessa nomenclatura em enzimas como a lactase, que hidrolisa a lactose; a urease, que catalisa a hidrólise da ureia; e a álcool desidrogenase, que catalisa a oxidação de álcoois.

A IUBMB (International Union of Biochemistry and Molecular Biology) estabelece a classificação oficial em seis classes de acordo com o tipo de reação catalisada:

Oxidorredutases: catalisam reações de transferência de elétrons (oxirredução), como as desidrogenases e oxidases;
Transferases: catalisam a transferência de grupos funcionais de uma molécula a outra, como as quinases (catalisam a transferência de fosfato) e aminotransferases;
Hidrolases: catalisam a hidrólise de ligações covalentes com consumo de água, como proteases, lipases e glicosidases;
Liases: catalisam a adição ou remoção de grupos por quebra de ligações, sem hidrólise nem oxirredução;
Isomerases: catalisam rearranjos intramoleculares de átomos, como a interconversão de isômeros;
Ligases: catalisam a formação de novas ligações covalentes com consumo de ATP, como as sintetases e carboxilases.

Sítio Ativo e Modelos de Especificidade

O sítio ativo é a região da enzima onde o substrato se liga e a catálise ocorre. Tal região trata-se de uma cavidade ou fenda tridimensional formada por resíduos de aminoácidos específicos que, embora possam estar localizados distantes um do outro na estrutura primária, ficam justapostos no espaço devido ao dobramento da proteína em sua estrutura terciária. Esses resíduos interagem com o substrato por meio de ligações de hidrogênio, interações eletrostáticas, interações hidrofóbicas e, em certos casos, por ligações covalentes transitórias.

O primeiro modelo que foi proposto para explicar a aparente especificidade enzimática foi o modelo de chave-fechadura, formulado por Emil Fischer em 1894. Em sua proposta, Fischer descrevia que o sítio ativo seria como uma estrutura rígida e geometricamente complementar ao substrato, fazendo uma analogia ao mecanismo de uma chave sendo capaz de encaixar apenas em sua respectiva fechadura. O modelo apresentava lacunas por ignorar a natureza dinâmica das proteínas e, hoje, sabe-se que o mecanismo chave-fechadura não é o que ocorre na realidade.

O modelo atualmente aceito é o do encaixe induzido, que foi proposto por Daniel Koshland em 1958. Segundo a teoria de Koshland, a ligação inicial do substrato no sítio ativo induz uma mudança na conformação da própria enzima, ajustando progressivamente a geometria do sítio ativo de forma complementar ao substrato, desde que este já tenha um arranjo espacial suficientemente adequado para a ligação.

A flexibilidade apresentada pelas enzimas é uma consequência da sua natureza proteica, visto que os ângulos diedros e dos grupos peptídicos, também discutidos na aula sobre proteínas, permitem a reconfiguração da estrutura terciária. A teoria do encaixe induzido também torna-se de fundamental importância para compreender o funcionamento da inibição enzimática, como veremos mais adiante, pois inibidores são capazes de estabilizar a enzima em conformações diferentes da ativa.

Cinética Enzimática

A cinética enzimática é responsável por descrever matematicamente a velocidade das reações catalisadas por enzimas em função de variáveis como a concentração de substrato, temperatura e pH. O molde mais fundamental para tal descrição foi desenvolvido por Leonor Michaelis e Maud Menten em 1913.

As enzimas catalisam as reações a partir da diminuição da energia de ativação necessária para que os reagentes atinjam o estado de transição (complexo ativado), processo que se dá pelo fato da enzima fornecer um mecanismo de reação alternativo em que o estado de transição é mais estável, reduzindo a energia necessária para sua formação sem alterar a variação da energia livre (ΔG).

Complexo Enzima-Substrato

O esquema geral de uma reação enzimática simples pode ser escrito como:

onde E é a enzima livre, S é o substrato, ES é o complexo enzima-substrato e P é o produto. A constante k₁ descreve a taxa de formação do complexo ES, k_-1 sua taxa de dissociação sem reação e k₂ (também chamada de k_cat ou constante catalítica) descreve a taxa de conversão de ES em produto e enzima livre regenerada.

A hipótese do estado estacionário (steady state), formulada por Briggs e Haldane, diz que, após um breve período transiente inicial, a concentração do complexo ES permanece aproximadamente constante, pois sua taxa de formação iguala sua taxa de decomposição por ambos os caminhos, como exemplificado pelo gráfico, onde EA e EB são intermediários catalíticos:

Equação de Michaelis-Menten

Ao combinar a hipótese do estado estacionário com a conservação da concentração total de enzima [E₀] = [E] + [ES], e definir a constante de Michaelis (K_m), é possível chegar à equação de Michaelis-Menten, em que:

\huge V_0=\frac{V_{\max}[S]}{K_m+[S]}

onde a constante de Michaelis é definida como:

\huge K_m=\frac{k_{-1}+k_2}{k_1}

e a velocidade máxima como:

\huge V_{\max}=k_2[E_0]

Nessa equação, v é a velocidade inicial da reação, [S] é a concentração de substrato, V_max é a velocidade máxima (que é atingida quando toda a enzima se encontra na forma ES) e K_m tem dimensão de concentração (mol/L).

Ao substituir [S] = K_m na equação, obtém-se que:

\huge V = \frac{V_{\max}}{2}

ou seja, K_m é numericamente igual à concentração de substrato na qual a velocidade da reação é exatamente a metade da velocidade máxima. Assim, um K_m baixo indica uma alta afinidade da enzima pelo substrato (visto que a meia saturação é atingida com pouca quantidade de substrato), enquanto um K_m alto sinaliza uma baixa afinidade. O gráfico de v em função de [S] tem como formato uma hipérbole, com v tendendo assintoticamente a V_max conforme [S] cresce indefinidamente.

Outro parâmetro cinético importante é a eficiência catalítica, definida como $\large \frac{k_{cat}}{K_{m}}$.

Ela quantifica a eficiência com que a enzima converte substrato em produto quando a enzima está longe da saturação (quando [S] << K_m), sendo o parâmetro mais adequado para comparar enzimas distintas atuando sobre diferentes substratos. O limite superior teórico da eficiência catalítica é da ordem de 10⁸ a 10⁹ M⁻¹s⁻¹, sendo restringido pela velocidade de difusão das moléculas em solução aquosa. As enzimas que atingem esse limite são chamadas de catalisadores perfeitos.

Linearização de Lineweaver-Burk

A determinação experimental de V_max e K_m a partir de uma hipérbole é imprecisa, visto que V_max é assintótico e jamais consegue ser realmente atingido em experimentos reais. Para contornar esse problema, Hans Lineweaver e Dean Burk propuseram, em 1934, tomar o inverso de ambos os lados da equação de Michaelis-Menten:

\huge \frac{1}{V_0}=\frac{K_m}{V_{\max}}\left(\frac{1}{[S]}\right)+\frac{1}{V_{\max}}

Essa é a equação de uma reta do tipo y = ax + b , onde o eixo y corresponde a $\frac{1}{v}$ e o eixo x corresponde a $\frac{1}{[S]}$. A equação possibilita, então, a leitura dos parâmetros cinéticos diretamente do gráfico:

O ponto de interceptação no eixo y (quando $\frac{1}{[S]} = 0$) fornece $\frac{1}{V_{max}}$;
O ponto de interceptação no eixo x (quando $\frac{1}{v} = 0$) fornece $-\frac{1}{K_{m}}$;
O coeficiente angular da reta é $\frac{K_{m}}{V_{max}}$.

O gráfico de $\frac{1}{v}$ por $\frac{1}{[S]}$ é chamado de gráfico de Lineweaver-Burk ou gráfico duplo recíproco. Sua maior vantagem é a linearização dos dados experimentais, permitindo a determinação de K_m e V_max por regressão linear e, como veremos a seguir, tornando visualmente perceptível a identificação do tipo de inibição enzimática.

Sua principal limitação, porém, é a amplificação dos erros experimentais nas regiões de baixas concentrações de substrato, que correspondem a altos valores de $\frac{1}{[S]}$ e que, no gráfico, ficam nos extremos mais distantes da reta.

Temperatura e pH Ótimos

Como enzimas são majoritariamente proteínas, sua atividade catalítica sofre influência direta de fatores que perturbam a estrutura proteica, especialmente a temperatura e o pH.

O gráfico da atividade enzimática em função da temperatura exibe um formato característico de sino. Em baixas temperaturas, a atividade da enzima é reduzida devido à diminuição da energia cinética das moléculas, que se traduz em uma menor frequência e menor energia de colisões entre enzima e substrato. Ao aumentar gradualmente a temperatura, a reação é acelerada, seguindo em um primeiro momento um padrão próximo ao esperado pela equação de Arrhenius, detalhada na aula “Fatores que influenciam na velocidade” do Curso NOIC de Físico-Química.

Entretanto, ao chegar acima de um determinado limiar térmico, a energia proveniente do calor supera as interações que estabilizam a própria estrutura tridimensional da proteína (ligações de hidrogênio intramoleculares, interações hidrofóbicas, pontes de sal e pontes dissulfeto), o que causa a desnaturação da enzima: a perda irreversível de sua estrutura terciária e, consequentemente, de sua atividade catalítica.

A temperatura ótima é aquela em que a atividade enzimática é máxima, correspondendo ao ponto de equilíbrio entre o benefício de uma cinética de reação acelerada e o início da desnaturação. Vale ressaltar que esse ponto não é universal, ou seja, cada enzima tem uma temperatura ótima distinta que varia enormemente entre organismos: enzimas de bactérias termofílicas de fontes hidrotermais, por exemplo, possuem temperaturas ótimas superiores a 70°C, enquanto as de organismos mesofílicos, como o ser humano, situam-se tipicamente entre 35°C e 40°C.

De forma análoga à temperatura ótima, o pH do meio influencia diretamente o estado de ionização dos resíduos de aminoácidos que compõem o sítio ativo. Resíduos de histidina (His), aspartato (Asp), glutamato (Glu), lisina (Lys) e arginina (Arg) possuem grupos ionizáveis (ácidos carboxílicos e aminas) cujo estado de protonação depende do pH do meio e de seus valores de pKa. Assim como na temperatura ótima, cada enzima possui um pH ótimo distinto no qual esses resíduos se encontram nos estados de ionização adequados para que a catálise seja eficiente.

Desvios do pH ótimo alteram as cargas do sítio ativo, prejudicando tanto a ligação com o substrato quanto a etapa catalítica. Podemos tomar como exemplo a pepsina, enzima proteolítica gástrica, que tem pH ótimo em torno de 2 (uma vez que é adaptada ao ambiente ácido do estômago), enquanto a tripsina, que possui função similar no intestino delgado, opera de forma ótima em pH próximo a 8. No gráfico abaixo, é possível ver as faixas de pH ótimo das enzimas pepsina (pepsin) e tripsina (trypsin):

Inibição Enzimática

A inibição enzimática é um dos mecanismos mais importantes de regulação metabólica e de ação farmacológica. Um inibidor é uma molécula que se liga à enzima e reduz sua atividade catalítica. Os inibidores são classificados de acordo com o local de ligação e o modo pelo qual afetam os parâmetros cinéticos K_m e V_max.

Inibição Competitiva

Na inibição competitiva, o inibidor I possui uma estrutura suficientemente semelhante à do substrato para competir pelo mesmo sítio ativo, estabelecendo o equilíbrio:

\huge E + I \rightleftharpoons EI \qquad K_i = \frac{[E][I]}{[EI]}

Como o inibidor ocupa o sítio ativo, ele impede que o substrato se ligue. Reciprocamente, altas concentrações de substrato podem superar a competição e deslocar o inibidor. Por isso, o efeito cinético característico é o aumento do K_m aparente (isto é, mais substrato é necessário para atingir meia saturação) sem alteração do V_max, que permanece acessível em concentrações suficientemente elevadas de substrato. O K_m aparente torna-se $K_m^{ap} = K_m\left(1 + \dfrac{[I]}{K_i}\right)$.

No gráfico de Lineweaver-Burk, a inibição competitiva produz retas com o mesmo ponto de interceptação no eixo y (mesmo $\frac{1}{V_{max}}$, pois V_max não muda), mas com coeficiente angular maior e ponto de interceptação no eixo x diferente (mais próximo de zero, o que reflete o maior K_m aparente).

Inibição Não Competitiva

O inibidor não competitivo (ou misto, na forma pura) liga-se a um sítio diferente do sítio ativo, chamado sítio alostérico, e pode se ligar tanto à enzima livre E quanto ao complexo ES, sem impedir a ligação do substrato em si. A ligação do inibidor causa uma mudança conformacional na geometria da enzima que reduz a eficiência catalítica. Na forma pura (mesma afinidade por E e por ES), o substrato ainda se liga normalmente (K_m inalterado), mas a conversão em produto é prejudicada, e o V_max aparente diminui por um fator $\left(1 + \dfrac{[I]}{K_i}\right)$.

No gráfico de Lineweaver-Burk, a inibição não competitiva pura produz retas com o mesmo ponto de interceptação no eixo x ($-\frac{1}{K_{m}}$ inalterado), mas com ponto de interceptação no eixo y maior (menor V_max) e coeficiente angular maior.

Inibição Incompetitiva (Acompetitiva)

A inibição incompetitiva (ou acompetitiva) é aquela na qual o inibidor somente se liga ao complexo ES já formado, e não à enzima livre. O inibidor é responsável por “capturar” o complexo ES e impedir que ele se converta em produto, não interferindo com a etapa inicial de ligação do substrato. Ao “roubar” ES do equilíbrio, ele desloca a reação E + S ⇌ ES no sentido da formação de mais complexo ES, segundo o princípio de Le Chatelier. O que então ocorre é uma redução simultânea do V_max aparente e do K_m aparente, ambos diminuindo pelo mesmo fator $\left(1 + \dfrac{[I]}{K_i}\right)$.

Esse aumento aparente de afinidade é um efeito puramente matemático do deslocamento de equilíbrio, e não representa uma melhora real da interação enzima-substrato.

No gráfico de Lineweaver-Burk, a inibição incompetitiva produz retas paralelas às do controle sem inibidor (ou seja, com o mesmo coeficiente angular), porém com ponto de interceptação no eixo y maior, que é a forma gráfica de reconhecer esse tipo de inibição.

A tabela a seguir resume os efeitos dos três tipos clássicos de inibição sobre os parâmetros cinéticos:

Tipo de Inibição	K_m aparente	V_max aparente	Lineweaver-Burk
Competitiva	Aumenta	Inalterado	Mesmo ponto de interceptação em y, mas ponto de interceptação em x diferente
Não competitiva (pura)	Inalterado	Diminui	Mesmo ponto de interceptação em x, mas ponto de interceptação em y diferente
Incompetitiva	Diminui	Diminui	Retas paralelas (mesmo coeficiente angular)

Inibidores Reversíveis e Irreversíveis

Os três tipos de inibição descritos acima (competitiva, não competitiva e incompetitiva) são casos de inibição reversível, pois o inibidor se liga à enzima por interações não covalentes (ligações de hidrogênio, interações hidrofóbicas, eletrostáticas) e pode ser removido por diluição ou competição.

Os inibidores irreversíveis, por sua vez, formam ligações covalentes estáveis com resíduos do sítio ativo, que causa a inativação da enzima de forma permanente. Um exemplo clássico de tal fenômeno é o ácido acetilsalicílico (aspirina), que acetila covalentemente o resíduo de serina da ciclooxigenase (COX), bloqueando irreversivelmente a via de síntese de prostaglandinas e conferindo seu efeito anti-inflamatório.

Outro exemplo de inibidores irreversíveis são os organofosforados, como o diisopropil fluorofosfato (DIFP), diversos inseticidas e agentes neurotóxicos. Essas moléculas reagem com o grupo hidroxila (-OH) de um resíduo de serina presente no sítio ativo de enzimas do tipo serina-hidrolase, formando uma ligação covalente do tipo fosfoéster. Essa modificação impede a participação da serina na catálise, levando à inativação irreversível da enzima, como representado na figura abaixo:

Observa-se que houve a substituição do átomo de flúor do DIFP pelo oxigênio da serina, resultando na fosforilação covalente do resíduo catalítico.

O fenômeno da inibição irreversível também tem grande importância clínica. A inibição irreversível da acetilcolinesterase, enzima do sistema nervoso responsável por degradar o neurotransmissor acetilcolina após a transmissão de impulsos nervosos, provoca o acúmulo desse neurotransmissor nas sinapses, levando à hiperestimulação dos receptores colinérgicos.

Como consequência, podem ocorrer manifestações como bradicardia, fasciculações musculares (contração involuntária de pequenos grupos de fibras musculares) e, em casos graves, insuficiência respiratória.

As ribozimas, que são enzimas de ribonucleotídeos, são excessão, não sendo proteínas globulares. ↩︎
“Holoenzima” deriva do prefixo grego hólos (que significa “todo” ou “inteiro”). ↩︎
“Apoenzima” deriva do prefixo grego apó- (que significa “separado de”, “derivado de”). ↩︎