Por: Letícia Frota Barreto.

Interação Luz-Matéria

Quando a luz branca incide sobre uma solução de sulfato de cobre, os olhos humanos percebem um tom azul. Isso ocorre porque a solução absorve as cores complementares (como o laranja e o vermelho) e deixa passar (transmite) a radiação na faixa do azul. A espectrofotometria transforma essa percepção visual em um método quantitativo, utilizando a quantidade de luz absorvida por uma substância para identificá-la (análise qualitativa) e determinar sua concentração (análise quantitativa).

Mecanismo de Absorção

Quando uma molécula recebe um fóton de luz na região do Ultravioleta ( $\lambda$ = 200 a 400 nm) ou do Espectro Visível ($\lambda$ = 400 a 800 nm), a energia desse fóton ($\Delta E$$\Delta E\[$$\Delta E$$$\Delta E$$) pode ser exatamente igual à diferença de energia entre o orbital eletrônico ocupado de maior energia (HOMO) e o orbital desocupado de menor energia (LUMO).

$$\Delta E = h \cdot f = \frac{h \cdot c}{\lambda}$$

Em que:

• $h$ é a constante de Planck ($6,6262 \cdot 10^{-34} \cdot J \cdot s$)
• $f$ é a frequência da luz ($s^{-1}$)
• $c$ é a velocidade da luz ($3 \cdot 10^8 m \cdot s^{-1}$)
• $\lambda$ é o comprimento de onda ($m$)

Nas moléculas orgânicas, os elétrons que sofrem essas transições pertencem geralmente a ligações duplas ou triplas (elétrons $\pi$) ou são elétrons não-ligantes, visto que têm mais liberdade de movimento. 

Estruturas com sistemas conjugados (ligações duplas e simples alternadas) absorvem comprimentos de onda maiores, deslocando-se para a região do visível, pois a diferença de energia ($\Delta{E}$$\Delta{E}$$\Delta E$$\Delta E$$$\Delta E$$) diminui à medida que a conjugação da molécula aumenta. Isso ocorre porque à medida que se adicionam ligações duplas e simples alternadas, os orbitais p paralelos de átomos vizinhos se sobrepõem e se misturam ao longo de toda a cadeia de carbono, gerando um sistema no qual o novo orbital HOMO tem sua energia elevada e o novo LUMO tem sua energia reduzida. Esse estreitamento do vão energético faz com que a molécula necessite de menos energia para excitar seus elétrons; como a energia do fóton é inversamente proporcional ao seu comprimento de onda, uma diminuição em $$\Delta E$$$\Delta{E}$$\Delta{E}$ desloca o pico de absorção para comprimentos de onda maiores.

Transmitância (T) e Absorbância (A)

Quando um feixe de luz com intensidade inicial $I_0$ atravessa uma cubeta de caminho óptico $l$ contendo uma solução, a intensidade da luz que emerge do outro lado é $I$.

A Transmitância (T) é a fração de luz que atravessa a amostra:

$T= \frac{I}{I_0}$ ou $T= \frac{I}{I_0} \cdot 100$%

Como a Transmitância varia de forma exponencial com a concentração da amostra, define-se a Absorbância (A), que é uma grandeza logarítmica e adimensional, facilitando correlações lineares:

A Lei de Beer-Lambert

A Lei de Beer-Lambert estabelece uma relação linear direta entre a absorbância e a concentração do analito:

Em que:

• $A$ : Absorbância (adimensional).
• $\epsilon$ : Coeficiente de extinção molar ou absortividade molar ($L \cdot mol^{-1} \cdot cm^{-1}$), que depende da identidade da substância e do comprimento de onda.
• $l$ : Caminho óptico da cubeta (geralmente $1 cm$).
• $C$ : Concentração da solução ($mol \cdot L^{-1}$).

 Instrumentação

•  O Espectrofotômetro de Feixe Simples:

Em um equipamento de feixe simples, a luz policromática de uma lâmpada passa por um monocromador (rede de difração), que separa os comprimentos de onda e seleciona uma faixa estreita para atravessar a amostra.

A transmitância é registrada como $\frac{I}{I_0}$, onde $I_0$ é a energia radiante que chega ao detector com a solução sem analito e $I$ é a energia que atinge o detector com a amostra. Nesse sistema, a solução sem analito e a amostra são inseridos alternadamente no mesmo caminho óptico. 

O modelo apresenta erro caso a intensidade da fonte de luz ou a resposta do detector variem entre as duas medições.

• O Espectrofotômetro de Duplo Feixe:

Para corrigir flutuações da lâmpada ou do detector ao longo do tempo, os aparelhos de duplo feixe utilizam um espelho rotatório (alternador de feixe). Este componente divide a luz que sai do monocromador em dois caminhos paralelos, enviando-a simultaneamente através da cubeta de referência e da cubeta da amostra até o detector.

As intensidades são comparadas em tempo real, cancelando variações instrumentais e permitindo varreduras rápidas de espectro.

• Fontes de radiação:

Em espectrofotômetros UV-Vís típicos, a cobertura de todo o espectro óptico é realizada pela alternância entre duas fontes principais: a lâmpada de deutério ($D_2$), que fornece radiação contínua na região do ultravioleta ($\lambda=$200 a 400 nm) por meio de descarga elétrica controlada, e a lâmpada de tungstênio, que opera nas regiões do visível e infravermelho próximo ($\lambda=$320 a 2500 nm).

Para garantir que o equipamento sempre utilize a fonte de maior intensidade e sensibilidade, a troca entre as lâmpadas ocorre automaticamente em $\lambda=$360 nm.

• Monocromador:

O monocromador é responsável por dispersar a radiação policromática nas suas componentes espectrais e selecionar uma faixa estreita de comprimento de onda (radiação monocromática) para incidir sobre a amostra. Sua estrutura básica consiste em uma fenda de entrada, espelhos colimadores e de focalização, um elemento de dispersão (rede de difração) e uma fenda de saída.

A rede de difração contém ranhuras paralelas gravadas em sua superfície. Ao incidir nessa estrutura, a radiação é refletida ou transmitida, e cada ranhura passa a se comportar como uma fonte pontual e independente de luz. Devido à difração e a interferência óptica, os diferentes comprimentos de onda são direcionados (dispersos) em ângulos distintos.

Em um monocromador de rede típico, o processo óptico ocorre nas seguintes etapas:

1. Colimação: A radiação policromática entra pela fenda de entrada e atinge um primeiro espelho côncavo, que transforma o feixe divergente em um feixe de raios paralelos (colimados).
2. Dispersão: Esse feixe paralelo atinge a rede de difração, onde os diferentes comprimentos de onda são difratados em ângulos específicos.
3. Focalização: A radiação dispersa incide em um segundo espelho côncavo, que focaliza cada comprimento de onda em um ponto distinto ao longo do plano focal de saída.
4. Seleção: Ao rotacionar mecanicamente a rede de difração, o pesquisador escolhe qual comprimento de onda exato será direcionado através da fenda de saída em direção à amostra.

• Materiais de Cubetas:

O material do porta-amostras varia conforme a região de análise:

• Vidro ou Plástico: Utilizados apenas na região do Visível, pois absorvem radiação ultravioleta.
• Quartzo: Transparente em todo o espectro (UV e Visível), sendo obrigatório para leituras abaixo de $\lambda=$350 nm.

Prática de Laboratório e Análise Quantitativa

•  O Espectro de Absorção e a Escolha de $\lambda_{máx}$:

O gráfico da variação da absorbância em função do comprimento de onda ($A$ vs $\lambda$) é chamado de espectro de absorção. O ponto de maior absorção é $\lambda_{máx}$. As análises quantitativas são realizadas nesse comprimento de onda específico devido a dois fatores:

1. Maior sensibilidade: Pequenas variações de concentração produzem as maiores variações de leitura.
2. Minimização de erros: No topo da curva, a inclinação é nula ($\frac{dA}{d\lambda} \approx 0$), reduzindo o impacto de pequenas flutuações do monocromador sobre o valor de absorbância obtido.

• O Método da Curva de Calibração:

Para quantificar um analito, preparam-se soluções padrão de concentrações conhecidas, mede-se a absorbância de cada uma e constrói-se um gráfico de Absorbância vs Concentração. A equação da reta gerada por regressão linear (y = ax + b) é utilizada para calcular a concentração das amostras desconhecidas a partir de suas respectivas absorbâncias.

•  Limitações e Desvios da Lei de Beer:

A linearidade da Lei de Beer-Lambert restringe-se a soluções diluídas (geralmente < 0,01 M). Os desvios são classificados em:

• Químicos: Em altas concentrações, as interações eletrostáticas entre as moléculas vizinhas alteram a distribuição de cargas e modificam o valor de $\epsilon$. Alterações de pH e equilíbrios químicos de associação ou dissociação também causam desvios.
• Instrumentais: Provocados por radiação espúria (luz que atinge o detector sem passar pela amostra) ou pelo uso de luz que não seja perfeitamente monocromática.

• Erros experimentais:

As condições físicas da cubeta afetam diretamente os resultados analíticos:

1. Marcas de dedos ou riscos: Espalham a luz incidente. Menos luz atinge o detector ($I$ diminui), resultando em uma absorbância falsamente elevada.
2. Cubeta molhada com solvente: Dilui a solução teste, diminuindo a concentração e gerando uma absorbância falsamente baixa.
3. Soluções turvas: provocam o espalhamento da luz por suspensão de partículas, elevando o valor de absorbância final.

• O Princípio da Aditividade (Análise de Misturas):

A absorbância é uma propriedade aditiva. Se dois componentes ($x$ e $y$) coexistem em uma mesma solução e absorvem luz no mesmo comprimento de onda, a absorbância total é a soma das contribuições individuais:

$A_{total}= \epsilon_{x} \cdot l \cdot C_{x} + \epsilon_{y} \cdot l \cdot C_{y}$

Para determinar as concentrações individuais de uma mistura, mede-se a absorbância total em dois comprimentos de onda distintos ($\lambda_1$ e $\lambda_2$), montando um sistema de equações lineares:

$A_{1}= \epsilon_{x, \lambda_1} \cdot l \cdot C_{x, \lambda_1} + \epsilon_{y, \lambda_1} \cdot l \cdot C_{y, \lambda_1}$

• Erro Fotométrico Relativo:

A precisão instrumental varia com o nível de absorbância da amostra. Em soluções muito diluídas ($A \rightarrow 0$), a intensidade de $I$ se aproxima de $I_0$ , tornando o sinal difícil de distinguir do ruído eletrônico do aparelho. Em soluções muito concentradas ($A > 1,5$), a quantidade de luz que chega ao detector é mínima, tornando a leitura vulnerável a erros causados por luz espúria. A faixa ideal de leitura, onde o erro fotométrico é mínimo, situa-se entre 0,3 e 0,8.