Sequenciamento (Sanger, NGS)

1. Visão Geral

Sequenciar DNA significa descobrir a ordem das bases A, T, C e G em uma molécula. Existem dois grandes conjuntos de métodos: o sequenciamento clássico (Sanger) e as tecnologias modernas de alto rendimento, conhecidas como NGS. O objetivo principal é transformar moléculas de DNA em dados que possam ser lidos, analisados e comparados.

Esses métodos se diferenciam principalmente pela forma como a cadeia de DNA é sintetizada ou lida e pela quantidade de moléculas que conseguem processar ao mesmo tempo.

2. Sequenciamento de Sanger

O método de Sanger, também chamado de chain-termination, funciona interrompendo a síntese do DNA em pontos aleatórios por meio dos ddNTPs. Esses ddNTPs são nucleotídeos modificados que não possuem o grupo 3’-OH, necessário para a polimerase adicionar a próxima base. Quando um ddNTP é incorporado, a síntese para imediatamente.

Comparação entre o didesoxinucleotídeo (ddNTP) com desoxinucleotídeo (dNTP).

Como o método funciona

  1. Mistura-se o DNA molde, um primer, DNA polimerase, dNTPs normais e uma pequena quantidade de ddNTPs marcados com fluorescência.
  2. A polimerase começa a copiar o DNA.
  3. A cada vez que um ddNTP entra no lugar de um dNTP, a cadeia termina.
  4. Ao final, existe uma coleção de fragmentos com comprimentos variados, cada um terminando em uma base específica.
  5. Esses fragmentos passam pela eletroforese capilar, e um detector identifica a fluorescência final de cada fragmento.
  6. A sequência é montada a partir da ordem crescente dos fragmentos.

Por que esse método é importante

Funcionamento do método Sanger.

O Sanger produz leituras relativamente longas (cerca de 400–1000 pares de bases) e com alta precisão. Ele é muito usado quando se deseja confirmar mutações ou estudar regiões menores do DNA.

3. Tecnologias NGS (Next-Generation Sequencing)

NGS representa o avanço para métodos capazes de sequenciar milhões de fragmentos ao mesmo tempo, reduzindo muito o custo por base e aumentando a velocidade.

Os princípios básicos envolvem preparar a amostra de DNA para leitura (chamado de library preparation) e, em seguida, usar plataformas que identificam cada base por sinais ópticos, elétricos ou químicos.

Fluxo de trabalho de sequenciamentos da nova geração.

Pontos essenciais antes de entrar nas plataformas

  • O DNA precisa ser fragmentado.
  • Adaptadores sintéticos são ligados às extremidades dos fragmentos.
    Esses adaptadores permitem:
    • prender os fragmentos à plataforma;
    • amplificar os fragmentos;
    • incluir índices (barcodes) para diferenciar amostras.
  • A leitura pode ser single-end (uma extremidade) ou paired-end (as duas extremidades do mesmo fragmento). Paired-end ajuda a montar regiões complexas, permitindo saber as posições relativas de partes distantes do DNA.

4. Illumina – Sequenciamento por Síntese

A plataforma Illumina é baseada na ideia de usar nucleotídeos reversivelmente bloqueados, cada um com uma fluorescência própria. Apenas uma base é adicionada por ciclo.

Passo a passo didático

  1. O DNA fragmentado com adaptadores é colocado na flow cell, uma lâmina especial.
  2. Acontece a bridge amplification, um processo onde cada fragmento gera um grupo de cópias idênticas chamado cluster.
  3. O sequenciamento começa:
    • A polimerase adiciona um único nucleotídeo fluorescente bloqueado.
    • Um laser excita essa molécula e a cor é detectada.
    • O bloqueio é removido.
    • O próximo ciclo começa.

Esse processo é repetido milhões de vezes em paralelo, gerando alto rendimento. Os reads são curtos (50–300 bases), mas extremamente numerosos.

5. Ion Torrent – Detecção de Íons H+

Em vez de fluorescência, o Ion Torrent mede variações de pH. Cada incorporação de nucleotídeo libera um H+, e sensores detectam essa mudança.

A principal limitação são regiões de muitos nucleotídeos iguais consecutivos (homopolímeros), pois a liberação de H+ cresce de maneira difícil de distinguir com precisão.

Esse detalhe costuma ser importante para resolver questões conceituais sobre erros desse método.

6. PacBio – SMRT (Single Molecule Real-Time)

No PacBio, o DNA é lido de forma contínua enquanto a polimerase adiciona nucleotídeos marcados com fluorescência. A plataforma usa estruturas chamadas ZMWs, onde somente o sinal da base recém-incorporada é detectado.

A grande vantagem está nos long reads, sequências longas que ajudam a atravessar regiões com repetições e a montar genomas complexos.

7. Nanopore – Leitura por Corrente Elétrica

O Nanopore lê o DNA enquanto ele atravessa um poro proteico, causando mudanças características na corrente elétrica. Cada base (ou combinação de bases) produz um padrão específico de sinal.

Esse método gera os maiores comprimentos de leitura, podendo ultrapassar 100 kb. Além disso, pode detectar modificações como metilação, porque alterações químicas mudam o padrão elétrico.

8. Comparação Geral

  • Sanger: ddNTPs bloqueiam a síntese; alta precisão; ideal para fragmentos menores.
  • Illumina: síntese com nucleotídeos bloqueados; usa fluorescência; gera milhões de reads curtos.
  • Ion Torrent: detecta H+ liberado; rápido e sem óptica; dificuldade em homopolímeros.
  • PacBio: leitura contínua em tempo real; long reads com boa precisão.
  • Nanopore: sinais elétricos ao passar por poros; ultra long reads; detecta modificações químicas.

Material feito por Carolina Fujimoto.