Southern Blot

O Southern blot é uma técnica laboratorial criada em 1975 por Edwin M. Southern com o objetivo de identificar sequências específicas de DNA dentro de uma amostra genômica. Embora tenha sido gradualmente substituída em muitos contextos por métodos mais rápidos como a PCR e o sequenciamento de nova geração (NGS), a técnica continua sendo uma ferramenta essencial em aplicações onde é necessária alta especificidade e análise estrutural do DNA.

Princípios gerais

O princípio do Southern blot baseia-se na hibridização molecular: a capacidade de fitas complementares de ácidos nucleicos se ligarem umas às outras. O método permite detectar um fragmento específico de DNA, mesmo em uma mistura muito complexa de outros fragmentos. Isso é feito combinando a eletroforese em gel, a transferência para uma membrana sólida e o uso de uma sonda de DNA marcada.

Etapas do Southern blot

A técnica envolve as seguintes etapas:

1- Extração do DNA:
O DNA genômico pode ser isolado de diferentes tipos de amostras biológicas, como sangue, saliva, cabelos ou tecidos. A escolha da amostra depende do objetivo experimental, sendo o tecido sanguíneo uma das fontes mais utilizadas por fornecer DNA de boa qualidade e em quantidade suficiente.

2- Digestão com enzimas de restrição:
O DNA é tratado com enzimas de restrição, endonucleases, que reconhecem sequências específicas e cortam a molécula em fragmentos menores. Essa digestão é feita em tampão enzimático, geralmente com incubação a 37 °C durante várias horas. A enzima escolhida deve ser compatível com a sequência de interesse e com o padrão de fragmentação desejado.

3- Eletroforese em gel de agarose:
Os fragmentos de DNA gerados pela digestão são separados por eletroforese em gel de agarose, para amostras maiores, ou gel de poliacrilamida, para amostras menores, de acordo com seu tamanho. Fragmentos maiores migram mais lentamente que os menores. Se os fragmentos excederem cerca de 15 kb (quilobase), pode-se tratar o gel com HCl diluído para depurinar o DNA, quebrando-o em pedaços menores e facilitando a transferência posterior.

4- Desnaturação:
O gel contendo os fragmentos é imerso em uma solução alcalina, geralmente com NaOH, que desnatura o DNA, separando as fitas duplas em fitas simples. Essa etapa é essencial para permitir a hibridização com a sonda e também contribui para a ligação eficiente do DNA à membrana.

5- Transferência para a membrana:
O DNA desnaturado é transferido do gel para uma membrana de nitrocelulose ou náilon. A transferência pode ser realizada por diferentes métodos: capilaridade ascendente ou descendente, eletroblotting (com campo elétrico), vácuo ou transferência simultânea para duas membranas. Em todos os casos, a transferência baseia-se na movimentação do tampão de uma região com alto potencial hídrico para outra com baixo potencial, arrastando o DNA do gel para a membrana, onde ele se liga por interações eletrostáticas.

6- Fixação:
Após a transferência, o DNA é fixado permanentemente à membrana. Isso pode ser feito por aquecimento (geralmente a 80 °C por 2 horas) ou por exposição à radiação ultravioleta, dependendo do tipo de membrana utilizada. Essa fixação garante que o DNA permaneça estável durante as etapas seguintes.

7- Hibridização com sonda:
A membrana contendo os fragmentos fixados é incubada com uma sonda de ácido nucleico complementar à sequência-alvo. Essa sonda pode ser marcada radioativamente, com fluorescência ou com compostos enzimáticos cromogênicos. Para reduzir ligações inespecíficas, utiliza-se DNA heterólogo (como DNA de esperma de peixe) para bloquear regiões não específicas da membrana, além de detergentes como SDS e aditivos como formamida.

8- Lavagem e detecção:
Após a hibridização, a membrana é lavada para remover sondas não ligadas. A detecção depende do tipo de marcador utilizado: por autorradiografia em filme (no caso de sondas radioativas), leitura por scanner (fluorescência) ou desenvolvimento de cor diretamente na membrana (sondas cromogênicas). O resultado final revela apenas os fragmentos que contêm a sequência complementar à sonda.

Interpretação dos resultados

As bandas visíveis na membrana correspondem a fragmentos de DNA que possuem sequências complementares à sonda utilizada, ou seja, que contêm a sequência-alvo. A posição da banda, determinada por comparação com um marcador de peso molecular, permite estimar o tamanho do fragmento e pode indicar alterações estruturais no DNA, como inserções, deleções ou mudanças no local de corte da enzima de restrição. O número de bandas reflete o número de fragmentos distintos contendo a sequência-alvo, o que pode sugerir a presença de múltiplas cópias gênicas, inserções transgênicas em diferentes locais do genoma ou polimorfismos de restrição (RFLPs). A ausência de banda pode indicar que a sequência-alvo foi deletada ou não está presente na amostra, mas também pode resultar de problemas técnicos, como digestão incompleta do DNA, falhas na transferência para a membrana ou hibridização ineficiente da sonda.

Exemplo:

O painel esquerdo mostra um gel de eletroforese com DNA de 9 clones de plasmídeos (linhas 1 a 9) e a ladder com fragmento de 400 pb na linha 10.
O painel do meio é o Southern blot do gel, usando uma sonda radioativa feita do DNA da linha 10 para detectar sequências homólogas.
O painel direito é o esquema do autoradiograma, mostrando a presença e tamanho das bandas.
Conclusão: Os clones 3, 4 e 8 têm a sequência alvo; o clone 6 apresenta fragmentos menores por variação genética; os demais clones não têm a sequência.

Aula elaborada por Carolina Fujimoto.